Tại sao phải đo độ đục theo McFarland?

Việc chuẩn hóa độ đục của huyền dịch vi khuẩn theo thang McFarland là một nguyên tắc nền tảng trong vi sinh lâm sàng và nghiên cứu, có ý nghĩa quyết định đến độ chính xác, khả năng tái lập và giá trị lâm sàng của các xét nghiệm vi sinh. Dưới đây là những lý do chính giải thích tại sao phương pháp này là bắt buộc.

1. Nguồn gốc lịch sử và nguyên lý của thang McFarland

Năm 1907, Joseph McFarland đã phát minh ra "nephelometer" (máy đo độ đục) để giải quyết nhu cầu cấp thiết trong việc chuẩn hóa huyền dịch vi khuẩn dùng cho tính toán chỉ số opsonin và bào chế vaccine [1]. Trước đó, phương pháp đếm trực tiếp của Wright đòi hỏi thời gian và công sức lớn, nhưng vẫn thiếu độ chính xác cần thiết [1]. McFarland nhận ra rằng độ đục (opacity) của huyền dịch vi khuẩn có thể được sử dụng như một chỉ số gián tiếp cho nồng độ vi khuẩn, và ông đã tạo ra các ống chuẩn hóa học bằng cách trộn dung dịch BaCl₂ 1% với H₂SO₄ 1% để tạo ra kết tủa BaSO₄ với các mức độ đục khác nhau (gọi là các chuẩn số 1, 2, 3,...10) [1]. McFarland đã chỉ ra rằng nếu không có các chuẩn cố định này, "việc lặp lại chính xác bởi chính nhà thí nghiệm hoặc bởi những người cố gắng lặp lại công trình của họ sẽ là không thể" [1].

Nguyên lý cốt lõi: các hạt vi khuẩn trong huyền dịch tán xạ ánh sáng, tạo ra độ đục (turbidity) tỷ lệ thuận với nồng độ sinh khối. Các chuẩn BaSO₄ bắt chước đặc tính tán xạ ánh sáng này, cho phép so sánh bằng mắt thường hoặc bằng máy đo quang [2,3].

2. Đảm bảo tính chuẩn hóa và khả năng tái lập trong kháng sinh đồ

Lý do quan trọng nhất của việc đo độ đục theo McFarland là kiểm soát chặt chẽ kích thước inoculum (lượng vi khuẩn cấy ban đầu) trong các xét nghiệm kháng sinh đồ — yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả.

Trong phương pháp khuếch tán đĩa (Kirby-Bauer): Cả CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) và EUCAST đều yêu cầu chuẩn hóa inoculum của vi khuẩn đến độ đục tương đương 0.5 McFarland (~1-2×10⁸ CFU/mL đối với hầu hết các vi khuẩn Gram âm) [4,7]. Điều này là tối quan trọng vì:

· Inoculum quá dày dẫn đến vòng vô khuẩn nhỏ hơn thực tế, gây sai lầm "kháng thuốc giả" (false resistance) [7].

· Inoculum quá loãng dẫn đến vòng vô khuẩn lớn hơn thực tế, gây sai lầm "nhạy cảm giả" (false susceptibility), hậu quả lâm sàng rất nghiêm trọng [7].

Holland và cộng sự (2009) nhấn mạnh rằng kết quả của xét nghiệm kháng sinh đồ có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào lượng vi khuẩn được thử nghiệm (hiệu ứng inoculum), cùng với loại môi trường nuôi cấy, điều kiện ủ và thời gian [4].

3. Ảnh hưởng của kích thước và hình dạng vi khuẩn đến độ đục

Việc đo độ đục đơn thuần không phản ánh trực tiếp số lượng vi khuẩn, bởi vì các loài khác nhau có kích thước, hình dạng và chiết suất khác nhau [5]. Nghiên cứu của Rye và Wiseman [5] trên Escherichia coli cho thấy các huyền dịch có cùng giá trị độ hấp thụ quang (absorbance) có thể chứa khối lượng tế bào khác nhau tùy thuộc vào thời điểm thu hoạch trong pha tăng trưởng logarit, do sự thay đổi về kích thước và hình dạng tế bào [5].

Moosdeen và cộng sự (1988) đã chứng minh rõ ràng rằng ở cùng một giá trị độ hấp thụ quang, các huyền dịch của các loài khác nhau chứa số lượng vi khuẩn sống rất khác nhau:

· Pseudomonas aeruginosa ở độ hấp thụ 0,4 chứa khoảng 3×10¹⁰ CFU/mL

· Staphylococcus aureus ở cùng độ hấp thụ chỉ chứa khoảng 8×10⁸ CFU/mL [6]

Vì vậy, để đạt được số lượng khuẩn lạc phù hợp cho tăng trưởng bán hợp lưu trong kháng sinh đồ, cần sử dụng các hệ số pha loãng khác nhau cho từng loài — điều này đòi hỏi phải bắt đầu từ một huyền dịch đã được chuẩn hóa theo độ đục [6].

4. Vai trò trong kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng xét nghiệm

Việc tuân thủ nghiêm ngặt quy trình chuẩn hóa inoculum theo McFarland là một phần của chương trình kiểm soát chất lượng (QC) toàn diện trong phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Wilson [8] nhấn mạnh rằng tạo ra dữ liệu kháng sinh đồ chính xác và tái lập được "đòi hỏi chương trình QC mở rộng nhất được sử dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng ngày nay" [8]. Các hướng dẫn của CLSI được công bố định kỳ và yêu cầu tuân thủ nghiêm ngặt từng bước của quy trình thử nghiệm [8,9].

Jones và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng trong các nghiên cứu QC đa trung tâm, việc kiểm soát inoculum (đếm khuẩn lạc từ khay vi pha loãng) phải đảm bảo nằm trong khoảng 1,6×10⁵ đến 8,0×10⁵ CFU/mL, với mục tiêu là 5,0×10⁵ CFU/mL [9]. Điều này khẳng định rằng việc chuẩn hóa inoculum theo McFarland là bước không thể thiếu.

5. Tính thực tiễn và hiệu quả kinh tế

Phương pháp McFarland có những ưu điểm thực tế vượt trội:

· Đơn giản và nhanh chóng: Có thể thực hiện trong 1-2 phút cho mỗi xét nghiệm [6].

· Chi phí thấp: Các chuẩn BaSO₄ có thể được bảo quản kín ở nhiệt độ phòng trong bóng tối và duy trì độ ổn định gần 20 năm [2].

· Không yêu cầu thiết bị đắt tiền: Có thể so sánh bằng mắt thường, hoặc sử dụng máy quang phổ thông thường [2,7].

Lahuerta Zamora và Pérez-Gracia [2] đã phát triển phương pháp chụp ảnh kỹ thuật số kết hợp với phần mềm IMAGEJ (miễn phí) để định lượng độ đục McFarland, mang lại độ tái lập cao (CV = 4,0%) — thậm chí vượt trội hơn máy đo độ đục chuyên dụng (CV = 4,7%) [2]. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các phòng thí nghiệm giảng dạy và các cơ sở ở các nước đang phát triển [2].

6. Ứng dụng trong các xét nghiệm khác

Ngoài kháng sinh đồ, thang McFarland còn được sử dụng trong:

· Xét nghiệm D-test: Phát hiện đề kháng clindamycin cảm ứng ở tụ cầu [7].

· Sàng lọc MRSA: Sử dụng thạch muối-oxacillin với inoculum 0.5 McFarland [4,10].

· Xét nghiệm ESBL: Sàng lọc và khẳng định β-lactamase phổ mở rộng [4,10].

· Định lượng vi khuẩn trong nghiên cứu: Phương pháp đo độ đục turbidimetric có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống trong các nghiên cứu diệt khuẩn theo thời gian (time-kill studies) [11].

Li và cộng sự (1993) đã phát triển một xét nghiệm turbidimetric để định lượng mật độ vi khuẩn sống dựa trên đường chuẩn từ các huyền dịch đã được chuẩn hóa theo McFarland, cho thấy tương quan tuyến tính tuyệt vời (r = 0,999) giữa mật độ vi khuẩn logarit và thời gian phát hiện tăng trưởng [11].

7. Đảm bảo khả năng tái lập liên phòng xét nghiệm

Tính tái lập của các phương pháp thử nghiệm kháng khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào việc chuẩn hóa inoculum. Parker và cộng sự (2018) đã chỉ ra rằng độ lệch chuẩn tái lập (reproducibility SD) của các phương pháp thử nghiệm kháng khuẩn có dạng "hình cau mày" (frown-shaped) — phụ thuộc vào hiệu quả của chất kháng khuẩn — và việc đánh giá khả năng tái lập đòi hỏi các tiêu chí thống kê khách quan [12]. Chuẩn hóa inoculum theo McFarland là bước đầu tiên để giảm thiểu biến thiên giữa các phòng xét nghiệm và giữa các lần thực hiện [12].

Kết luận

Tóm lại, việc đo độ đục theo thang McFarland là bắt buộc vì nó là phương pháp chuẩn hóa đã được kiểm chứng, đảm bảo:

1. Tính chính xác và tin cậy của các kết quả kháng sinh đồ phục vụ điều trị lâm sàng

2. Khả năng tái lập giữa các phòng xét nghiệm và giữa các lần thực hiện

3. Tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế (CLSI, EUCAST)

4. Tính thực tế với chi phí thấp, dễ thực hiện

5. Cơ sở khoa học vững chắc dựa trên mối tương quan giữa độ đục và nồng độ sinh khối vi khuẩn

Bất kỳ sai lệch nào trong việc chuẩn hóa này đều có thể dẫn đến kết quả sai lệch, ảnh hưởng trực tiếp đến quyết định điều trị kháng sinh và hậu quả lâm sàng cho người bệnh.

Tài liệu tham khảo

[1] McFarland J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. JAMA. 1907;XLIX(14):1176. DOI: 10.1001/jama.1907.25320140022001f

[2] Lahuerta Zamora L, Pérez-Gracia MT. Using digital photography to implement the McFarland method. Journal of the Royal Society Interface. 2012;9(73):1892–1897. DOI: 10.1098/rsif.2011.0809

[3] Gates FL. A method of standardizing bacterial suspensions. Journal of Experimental Medicine. 1920;31(1):105–114. DOI: 10.1084/jem.31.1.105

[4] Holland TL, Woods CW, Joyce M. Antibacterial susceptibility testing in the clinical laboratory. Infectious Disease Clinics of North America. 2009;23(4):757–790. DOI: 10.1016/j.idc.2009.06.001

[5] Rye RM, Wiseman D. Some observations on the use of absorbance measurements in bacteriology. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 1968;20(Suppl 1):23S–25S. DOI: 10.1111/j.2042-7158.1968.tb09855.x

[6] Moosdeen F, Williams JD, Secker A. Standardization of inoculum size for disc susceptibility testing: a preliminary report of a spectrophotometric method. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1988;21(4):439–443. DOI: 10.1093/jac/21.4.439

[7] Kuper KM, Boles DM, Mohr JF, Wanger A. Antimicrobial susceptibility testing: a primer for clinicians. Pharmacotherapy. 2009;29(11):1326–1343. DOI: 10.1592/phco.29.11.1326

[8] Wilson ML. Medical microbiology: assuring the quality of clinical microbiology test results. Clinical Infectious Diseases. 2008;47(8):1077–1082. DOI: 10.1086/592071

[9] Jones RN, Anderegg TR, Swenson JM. Quality control guidelines for testing Gram-negative control strains with polymyxin B and colistin (polymyxin E) by standardized methods. Journal of Clinical Microbiology. 2005;43(2):925–927. DOI: 10.1128/jcm.43.2.925-927.2005

[10] Boyd JF, Sommerville JW. Standard barium sulphate suspensions. Journal of Clinical Pathology. 1960;13(1):85–86. DOI: 10.1136/jcp.13.1.85

[11] Li RC, Nix DE, Schentag JJ. New turbidimetric assay for quantitation of viable bacterial densities. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993;37(2):371–374. DOI: 10.1128/aac.37.2.371

[12] Parker AE, Hamilton MA, Goeres DM. Reproducibility of antimicrobial test methods. Scientific Reports. 2018;8(1):12531. DOI: 10.1038/s41598-018-30282-3